Metamizol a gojenie kości – wyniki badań eksperymentalnych

Czy metamizol wpływa na regenerację kości?

Metamizol nie zaburza gojenia kości w warunkach niedokrwienia – wyniki eksperymentalnego badania na modelu mysim

Metamizol, popularny nieopioidowy lek przeciwbólowy, jest często stosowany w leczeniu ostrego i przewlekłego bólu u pacjentów po urazach kostnych. Oprócz działania przeciwbólowego wykazuje również właściwości przeciwgorączkowe i spazmolityczne. Dotychczas nie było jednak jasne, czy stosowanie metamizolu jest bezpieczne u pacjentów ze złamaniami, którzy jednocześnie cierpią na choroby naczyniowe powodujące niedokrwienie tkanek. Naukowcy postanowili zbadać ten problem wykorzystując model doświadczalny, który odzwierciedla trudne warunki kliniczne.

Metamizol jest prolekiem, który po podaniu doustnym ulega hydrolizie do pierwszego aktywnego metabolitu – 4-metyloaminoantypiryny (4-MAA), a następnie do 4-aminoantypiryny (4-AA). Wcześniejsze badania sugerowały, że metamizol może oddziaływać na układ endokannabinoidowy i receptory opioidowe. Wykazano również, że hamuje cyklooksygenazę (COX)-1, COX-2 i COX-3, z których COX-2 jest niezbędna w procesie gojenia kości. “Dokładny mechanizm działania metamizolu nadal pozostaje nie w pełni wyjaśniony” – zaznaczają autorzy badania.

Niedokrwienie, takie jak to występujące w chorobie tętnic obwodowych, jest częstym schorzeniem współistniejącym u pacjentów ze złamaniami. Proces gojenia kości wymaga precyzyjnie skoordynowanej sekwencji zdarzeń, które mogą być zaburzone przez niedokrwienie spowodowane urazami naczyniowymi lub chorobami naczyniowymi. W badaniach in vitro wykazano, że metamizol ma niekorzystny wpływ na komórki osteoblastyczne. Jednak w warunkach fizjologicznych nie zaobserwowano hamującego wpływu metamizolu na gojenie złamań piszczeli u gryzoni.

Jak eksperymentalnie oceniono wpływ metamizolu?

Celem badania było przeanalizowanie wpływu klinicznie istotnej dawki metamizolu na gojenie kości oraz ustalenie, czy metamizol może być stosowany podczas leczenia złamań w warunkach niedokrwienia w praktyce klinicznej. Badacze wykorzystali dobrze ugruntowany model złamania kości udowej u myszy w warunkach niedokrwienia, który naśladował trudne kliniczne warunki gojenia.

W badaniu wykorzystano 44 myszy CD-1 (26 samców i 18 samic) o masie ciała 40 ± 7 g i wieku 130 ± 5 dni. Zwierzęta były hodowane w Instytucie Chirurgii Klinicznej i Eksperymentalnej (Uniwersytet Saary, Homburg, Niemcy), utrzymywane w regularnym 12-godzinnym cyklu światła i ciemności oraz miały swobodny dostęp do wody z kranu i standardowej karmy w granulkach. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym ochrony zwierząt i wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz zostało zatwierdzone przez lokalne władze.

W badaniu wykorzystano ugruntowany model złamania niedokrwiennego u myszy. Do zabiegu chirurgicznego myszy były znieczulane przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny. Krótko mówiąc, wykonano 6-milimetrowe nacięcie przyśrodkowe przyrzepkowe w prawym kolanie w kierunku tętnicy i żyły udowej. Umiarkowane niedokrwienie kończyny tylnej wywołano przez podwiązanie prawej głębokiej tętnicy udowej na udzie. Następnie otwarto torebkę stawu kolanowego przez nacięcie przyśrodkowe do rzepki i odsłonięto kłykcie udowe przez lateralizację rzepki. Po wywierceniu otworu w wcięciu międzykłykciowym, igłę iniekcyjną o średnicy 0,4 mm wprowadzono do kanału szpikowego. Następnie przez igłę wprowadzono do kanału szpikowego prowadnicę wolframową. Po usunięciu igły złamano kość udową za pomocą urządzenia do zginania trzypunktowego. Śrubę tytanową śródszpikową implantowano nad prowadnicą w celu stabilizacji złamania. Złamanie i pozycję implantu potwierdzono radiograficznie.

Zwierzęta zostały losowo przydzielone do jednej z dwóch grup badawczych. Zwierzęta z grupy metamizolu (n = 23) otrzymywały 50 mg/kg metamizolu dziennie doustnie od dnia operacji. Zwierzęta z grupy kontrolnej (n = 21) otrzymywały równoważną objętość nośnika (0,9% NaCl). Dawka metamizolu została dobrana tak, aby odpowiadała maksymalnej dziennej dawce stosowanej u dorosłych pacjentów (około 50 mg/kg masy ciała dla osoby o wadze 80 kg). Zwierzęta zostały uśmiercone przez dyslokację szyjną po 2 tygodniach (n = 13 w grupie kontrolnej; n = 15 w grupie metamizolu) lub 5 tygodniach (n = 8 w każdej grupie) po operacji.

Aby ocenić, czy stężenia metamizolu u myszy są porównywalne do tych u ludzi, analizowano poziomy w surowicy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Próbki krwi pobierano 30, 60 i 90 minut po ostatnim podaniu doustnym metamizolu. Analiza wykazała wysokie poziomy 4-MAA we wszystkich badanych punktach czasowych, natomiast stężenie 4-AA było niskie po 30 i 60 minutach, ale znacząco wzrosło po 90 minutach. “Wyniki te wskazują na przyjmowanie i metabolizm metamizolu, jakiego można by również oczekiwać podczas stosowania klinicznego” – podkreślają badacze.

Do analizy biomechanicznej wykorzystano zarówno złamane prawe, jak i zdrowe lewe kości udowe z obu grup po 2 tygodniach (n = 8 w grupie kontrolnej; n = 10 w grupie metamizolu) i 5 tygodniach (n = 8 w każdej grupie). Po usunięciu implantów, sztywność kalusa mierzono za pomocą testu niedestrukcyjnego przy użyciu urządzenia do zginania trzypunktowego. Obciążenie zatrzymywano indywidualnie w każdym przypadku, gdy aktualna krzywa obciążenie-przemieszczenie odbiegała o więcej niż 1% od liniowości. Sztywność zginania [N/mm] obliczano z liniowej elastycznej części wykresu obciążenie-przemieszczenie po zastosowaniu stopniowo zwiększającej się siły zginającej z prędkością 1 mm/min. Analizowano również nienaruszone lewe kości udowe, które służyły jako wewnętrzna kontrola.

Analizy biomechaniczne przeprowadzone 2 i 5 tygodni po operacji nie wykazały istotnych różnic między grupą metamizolu a grupą kontrolną. W obu grupach sztywność zginania była niska 2 tygodnie po operacji i wyższa 5 tygodni po operacji, co wskazuje na postępujący proces gojenia. Jednakże stosunek sztywności biomechanicznej między kośćmi złamanymi a nienaruszonymi był bardzo niski po 2 tygodniach i wskazywał na niepełną stabilność kostną złamanych kości udowych po 5 tygodniach od operacji w obu grupach. Potwierdza to opóźnione gojenie kości w użytym modelu złamania niedokrwiennego.

Badania rentgenowskie złamanych kości udowych przeprowadzono 2 tygodnie i 5 tygodni po operacji. Gojenie złamań analizowano zgodnie z klasyfikacją Goldberga, gdzie stopień 0 oznacza radiologiczny brak zrostu, stopień 1 oznacza możliwy zrost, a stopień 2 oznacza radiologiczny zrost. Zdjęcia rentgenowskie zwierząt z grupy kontrolnej i metamizolu wykazywały oznaki postępującego gojenia przez cały okres badania. Średni wynik Goldberga po 2 tygodniach od złamania wynosił 0,80 ± 0,13 dla zwierząt leczonych metamizolem i 0,75 ± 0,16 dla zwierząt kontrolnych, podczas gdy po 5 tygodniach średni wynik dla zwierząt leczonych metamizolem wynosił 1,88 ± 0,12, a dla zwierząt kontrolnych 2,0 ± 0,0.

Ponadto przeprowadzono mikrotomografię komputerową (µCT) złamanych kości udowych 2 tygodnie i 5 tygodni po operacji. Skanowanie przeprowadzono przy rozdzielczości przestrzennej 9 μm ze standardowym ustawieniem. Na każdym przekroju poprzecznym region zainteresowania (ROI) był konturowany ręcznie, definiując wyłącznie nową kość i wykluczając oryginalną kość korową. Następujące parametry µCT obliczono dla każdej próbki: objętość kości (BV; mm³), objętość tkanki (TV; [mm³]), stosunek BV/TV (%) oraz parametry beleczkowe, takie jak liczba beleczek (TbN; [1/mm]), separacja beleczek (TbSp; [mm]) i grubość beleczek (TbTh [mm]).

Badania radiologiczne (rentgenowskie i mikrotomokomputerowe) nie wykazały istotnych różnic między grupami w zakresie objętości kości (BV), objętości tkanki (TV) oraz stosunku BV/TV. Stosunek ten wykazał jednak znaczący wzrost tkanki kostnej jako frakcji TV między 2 a 5 tygodniem po operacji dla każdej grupy, co jest wskaźnikiem postępującego gojenia kości. Analiza µCT struktur beleczkowych nie wykazała istotnych różnic między obiema grupami badawczymi dla TbN, TbSp i TbTh.

Do analiz histomorfometrycznych kości utrwalano w 4% buforowanej fosforanem formalinie przez 24 godziny i odwapniano w roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przez 14 dni. Przeprowadzono odwodnienie w rosnącej serii alkoholi. Po zatopieniu odwapnionych kości w parafinie, wykonano przekroje podłużne o grubości 5 µm i barwiono Safranin-O. Przy powiększeniu 12,5 × obliczano wskaźniki strukturalne. Do oceny histomorfometrycznej mierzono następujące parametry: (i) całkowitą powierzchnię kalusa okostnowego, (ii) powierzchnię kalusa kostnego, (iii) stosunek powierzchni tkanki kostnej do całkowitej powierzchni kalusa.

Analiza histomorfometryczna 2 tygodnie po operacji wykazała dużą powierzchnię kalusa z przeważającym brakiem pomostowania kostnego w obu grupach. Natomiast 5 tygodni po operacji tkanka kostna pomostowała początkowe miejsce złamania w obu grupach. Całkowita powierzchnia kalusa nie różniła się między dwiema grupami. Całkowita powierzchnia kalusa była mniejsza po 5 tygodniach niż po 2 tygodniach w każdej grupie jako typowy objaw przebudowy kości. Zgodnie z tym, frakcja tkanki kostnej całkowitej powierzchni kalusa zwiększała się w czasie w obu grupach, podczas gdy porównania międzygrupowe tego parametru nie wykazały różnic.

Jakie wnioski płyną z badań molekularnych i klinicznych?

Interesujące wyniki przyniosła analiza Western blot, która ujawniła znacząco wyższą ekspresję proangiogennego czynnika Cyr61 w tkance kalusa zwierząt leczonych metamizolem w porównaniu z grupą kontrolną 2 tygodnie po operacji. Ekspresja CD31 nie różniła się między grupami. Marker osteoklastyczny RANKL wykazywał zwiększoną ekspresję w tkance kalusa zwierząt leczonych metamizolem, podczas gdy ekspresja OPG nie wykazywała istotnych różnic. Ekspresja RUNX2, wskaźnika osteoblastów, była znacząco wyższa w kalusie zwierząt leczonych metamizolem niż w kalusie zwierząt kontrolnych. Ekspresja markera proliferacji PCNA nie różniła się między dwiema grupami w tym wczesnym punkcie czasowym.

Czy te zmiany molekularne wpływają na proces gojenia kości? “Ustalenia te wskazują na nieco inny profil ekspresji u zwierząt leczonych metamizolem w porównaniu z kontrolami, wskazując na tendencję w kierunku wyższej aktywności angiogennej i przyspieszonego obrotu kostnego 2 tygodnie po operacji” – wyjaśniają autorzy. Podczas gdy zwiększona ekspresja Cyr61 i RUNX2 wskazuje na efekt angiogenny i osteoanaboliczny, zwiększona ekspresja RANKL bez różnic w ekspresji OPG może wskazywać na zwiększony efekt osteokatabolityczny. Metamizol mógł zatem zwiększyć obrót kostny, nie przyspieszając ani nie zapobiegając gojeniu kości.

Jakie wnioski płyną z tego badania dla praktyki klinicznej? Badanie wykazało, że metamizol nie wpływa na gojenie złamań nawet w trudnych warunkach niedokrwienia. Złamania, które muszą goić się w warunkach patologicznych, takich jak niedokrwienie, najprawdopodobniej będą negatywnie wpływać na proces gojenia i mogą nawet nie goić się wcale. Co ciekawe, metamizol zwiększa apoptozę w komórkach podobnych do osteoblastów in vitro i hamuje COX-1, COX-2 i COX-3, z których COX-2 jest niezbędna do gojenia kości. Jednak w warunkach fizjologicznych metamizol nie wywierał szkodliwego wpływu na gojenie kości w niestabilizowanych złamaniach piszczeli u szczurów.

Zgodnie z tymi ustaleniami, w obecnym badaniu również nie wykryto żadnych negatywnych skutków metamizolu na gojenie kości w warunkach niedokrwienia, co wykazały wyniki biomechaniczne, radiologiczne i histomorfometryczne. Jednak w trudnych warunkach tego modelu, metamizol nieznacznie zmienił wzór ekspresji białek w tkance kalusa 2 tygodnie po operacji w porównaniu z kontrolami. “Chociaż oczywiście należy zachować ostrożność przy przenoszeniu wyników badań na zwierzętach do zastosowań u ludzi, leczenie metamizolem może być również zalecane w analgezji u pacjentów ze złamaniami cierpiących na choroby współistniejące powodujące niedokrwienie tkanek” – konkludują badacze.

Czy wyniki te mogą zmienić podejście do stosowania metamizolu u pacjentów ortopedycznych? Badanie dostarcza istotnych dowodów, że metamizol może być bezpiecznym wyborem w leczeniu bólu u pacjentów ze złamaniami, którzy jednocześnie cierpią na choroby naczyniowe. Lekarze powinni jednak pamiętać, że metamizol może modyfikować ekspresję białek związanych z procesem gojenia kości, co sugeruje potrzebę dalszych badań w tym obszarze, szczególnie u pacjentów z wysokim ryzykiem zaburzeń gojenia kości.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie eksperymentalne na modelu mysim wykazało, że metamizol nie wpływa negatywnie na proces gojenia kości w warunkach niedokrwienia. W eksperymencie wykorzystano 44 myszy, którym podawano metamizol w dawce odpowiadającej maksymalnej dawce stosowanej u ludzi. Analiza biomechaniczna, radiologiczna i histomorfometryczna nie wykazała istotnych różnic w procesie gojenia między grupą otrzymującą metamizol a grupą kontrolną. Zaobserwowano jedynie niewielkie zmiany w ekspresji białek w tkance kalusa po 2 tygodniach od operacji, wskazujące na zwiększoną aktywność angiogenną i przyspieszony obrót kostny. Wyniki sugerują, że metamizol może być bezpiecznym wyborem w leczeniu bólu u pacjentów ze złamaniami i współistniejącymi chorobami naczyniowymi, choć konieczne są dalsze badania w tym zakresie.